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  Chapitre VIII: La fixation de l'azote moléculaire

 

 

  1. La fixation non symbiotique de l'azote

 

  1. Généralités

 

L'azote est un des constituants de la matière organique , on le retrouve dans les protéines , les acides nucléique , ATP et vitamines

L'azote comme le carbone fait partie d'un grand cycle biologique.

 

L'ammoniaque n'est pas directement absorbable par les plantes il passe par une nitrification puis capté par les plantes, c'est donc une assimilation.

Nitrate et nitrite se retrouve dans l'eau, les nitrates dans le sang humain se transforme en nitrite, et les nitrites fixe l'oxygène. Ce qui peut provoquer des problèmes respiratoire grave .

 

L'azote représente 80 % de l'atmosphère, les eucaryotes sont incapable d'utiliser cette azote moléculaire. Ils ne peuvent le faire que si ils vivent en symbiose avec d'autres organismes, c'est la fixation symbiotique. Car certains procaryote sont capable d'utiliser directement l'azote moléculaire par la réaction de Haber – Bosh. Cette réaction nécessite une enzyme la nitrogénase.

 

3H2 + N2

 

Cette réaction peut se faire artificiellement , mais elle nécessite une température de 500° et du pression de 300 atmosphéres

 

     

  1. la découverte de la nitrogénase

 

On n'a cherché à la purifié pour avoir une idée de ses caractéristiques. Travail commencé entre 1940 et 1950, et c'est en 1960 qu'on a pu purifier cette enzyme dans une bactérie du genre Clostridium.

Cette enzyme est une férro protéine, et elle est très sensible au dioxygéne qui est un antagoniste puissante de ce l'enzyme. Tous les microorganismes ont en commun un complexe de gène ( le complexe NIF nitrogène fixing)qui code pour la synthèse de la nitrogène et pour la protéine qui interviennent dans l'activité de la nitrogènase.

 

  1. Les stratégies développées pour éviter le O2

 

 

Les mécanismes ont développées diverses mécanismes .

 

.Vivre en anaérobiose. Clostridium

.Vivre en anaérobiose facultative. Klebsiella (qui ne fixe l'azote qu'en milieu anaérobie)

.Création d'une barrière de protection rudimentaire: Rhizobium (formes des colonies entourés par un amas gélatineux, ainsi il y a crétion d'une barrière contre la diffusion du 02

.La formation de compartiment spécialisés . Cyanobactéries. (cellule rigide avec paroi épaisse appelé hétérocystes)

.Activation du système respiratoire qui se traduit par une consommation intense de 02 et donc réduction de la pression partiel du 02 dans les cellules bactérienes: Azotobacter

dans certains cas il se développe même une deuxième chaîne respiratoire mais avec un très faible couplage énergétique.

.Possibilité d'un changement de la conformation de nitrogénase chez certains Azotobacter

on a pu mettre en évidence la présence d'une protéine contenant du fer et du souffre qui se fixe au niveau du site catalytique de la nitrogénase et évite ainsi la contacte avec le 02

.Possibilité d'activer la synthèse de nouvelles molécules de nitrogénase ainsi les enzymes inactivés par l'O2 sont remplacés par des nouvelles.

 

 

  1. Structure de la nitrogénase

 

a)La structure de la nitrogénase

 

Cette enzyme comprend en réalité deux protéines distinctes , une protéine P1 d'un point moléculaire de 220 KD c'est une protéine constitué de 4 sous unités et contenant du molybdène et du fer , le site catalytique de la nirogénase est localisé au niveau ce cette protéine que l'on nomme alors dinitrogénase.

La protéine P2 d'un point moléculaire de 50 à 60 KD c'est une protéine constitué de deux sous unités et contenant du fer. Le rôle de cette protéine et de transféré les électrons nécessaire à la réduction de l'azote par la dinitrogénase, cette protéine est alors appelé dinitrogénase réductase.

La nitogénase existe généralement sous cette forme, mais il existe quelques variantes concernant leur emplacement du molybdène.

 

 

 

 

Mais le degré de conservation de cette enzyme est tel que si vous prennez la protéine PI d'une espèce 'a ' et que vous la relié à une PII d'une espèce bactérienne 'b' vous obtenez une nitrogénase active.

 

 

b) Le fonctionnement de la nitrogénase

 

La nitogénase à pour but la fixation biologique de l'azote par la réaction de Haber- Bosh .

Cette réduction se fait par un transfert d'électron qui s'effectue entre la dinitrogénase réductase et la dinitrogénase et elle nécessite de l'ATP .

Il a été établie que 4 molécules d'ATP sont hydrolysé à chaque cycle de transfert de deux électrons , comme il faut plusieurs électrons pour réduire l'azote atmosphérique on aura en réalité la réaction globale suivante :

N2 + 8H+ + 8e- 2(NH3) + H2

 

La réaction catalyse par la nitrogénase nécessite beaucoup d'énergie ce qui explique qu'elles n'utilisent pas tout le temps se système. Si on donne des substrats azotés , il y a répression du complexe 'NIF'.

Le transfert d'électron ne s'effectue qu'après hydrolyse de l'ATP .On pense que cette réaction favorise l'interaction entre PII et PI de la nitrogénase.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. La fixation symbiotique de l'azote

 

 

  1. La symbiose Rhyzobiums- Légumineuses

 

 

a) Historique

 

C'est pour ses conséquences agronomiques , augmentation d'un facteur 10 de la fixation d'azote au cours d'un cycle de culture par rapport aux autres plantes que cette symbiose a été étudié depuis le XIX siècle.

Cette assimilation d'azote atmosphèrique par les légumineuses a été montré pour la première fois par Bourssingault en 1838 .

En 1888 Beijerinck montre qu'elle est du à la présence de bactérie du genre rhyzobium dans leur racines. Depuis la caractérisation de la symbiose a été poussé jusqu'au niveau moléculaire.

Les rhyzobium se situe dans des nodules, que l'on trouvent le plus souvent au niveau des racines mais parfois également au niveau des tiges.

Les rhyzobias contenant la nitrogènase , c'est à se niveau que se formera l'ammoniac à partir de l'azote atmosphérique

 

b) Attachement des bactéries aux poils absorbants

 

La reconnaissance entre les deux partenaires se fait par chimiotactisme , des composés variés présent dans les exudats racinaires sont corrélé avec une augmentation de la population de rhyzobium autour de la racine des légumineuses.

D'une part un ensemble du métabolite carboné comme les a.a , les glucides et les acides organiques potentiellement métabolisable par les saprophytes attirent les bactéries de manière aspécifiques.

D'autres parts des composés plus spécifiques joueraient un rôle plus précis dans la reconnaissance :

-Les flavonoïdes

-Les lectines (protéines)

 

Au niveau des racines se sont les flavonoïdes qui vont être les plus importants car ils vont agir sur un opérons bactérien qui englobe les gènes nod (pour nodulation).

Il en existe trois type :

  • nod ABC

  • nod D

  • nod H

 

Il y aura alors formation de facteur de nodulation( bactérien) des produits qui vont agirent sur les cellules des poils absorbants et les cellules corticales racinaires. Ces facteurs sont donc des agents morphogènes.

On peut voir cela à 4 facteurs différents :

  • Ces facteurs nos sont capables a eux seuls de déformés les poils absorbants a des concentrations de 10 ‾9à 10‾12

  • D'induire la division corticales de concentration de 10‾7 à 10‾9 M

  • D'induire l'expression symbiotique de la plante à des concentrations de 10‾10 à 10‾13 M

  • D'induire la formation de nodule en l'absence des bactéries à des concentrations de 10‾7 à 10‾9 M

 

Le produit des gènes nod va déformaient en moyenne 25% des poils absorbants de la racine, selon un processus qui fait intervenir une croissance localisée.

En un point du poil il y aura croissance du poil et non de l'autre → courbure du poil.

Au cours de l'incurvation les bactéries vont être emprisonnés au voisinage de la cavité qui va se formé

 

  1. Formation d'un cordon d'infection

 

Les bactéries vont alors dissoudre les parois des cellules des poils absorbants et vont progresser en direction des cellules du cortex de la racine.

Elles vont s'entourer d'une couche formé de mucopolysaccharides et de fragments de membranes l'ensemble forme le cordon d'infection

 

e) La division des cellules corticales

 

Il va y avoir alors division des cellules corticales qui vont entrainer la formation du nodule.

Les bactéries seront alors entouré d'une membrane de séquestration , selon les espèces cette membrane peut entouré une ou deux bactéries.

 

 

f) Des modifications biochimiques

 

  • Au niveau des bactéries la nitrogènase est synthétisé très rapidement et en très grande quantité, après la libération des bactéries dans les cellules infectés. A partir de ce moment on constate que la bactérie change de forme et devient bactéroïde, elle est plus grosse qu'une bactérie normal.

     

  • Au niveau des plantes , l'activation des gènes symbiotiques de la plante a entrainé la formation de nouvelle protéine les noduline (ex: la leghémoglobine). Une protéine affine pour le dioxygène qui protège alors les bactéries de l'oxydation. La leghèmoglobine est une protéine cosynthètisé car la plante fabrique la partie protéiques et la bactérie l'hème. Elle colore en rouge le contenu des nodules. Cette protéine a une affinité 10 à 20 fois plus élevé pour le dioxygène que la myoglobine du muscle. Son rôle permettra donc de diminuer fortement la concentration du dioxygène dans le nodule.

     

  • Les interactions entre plantes et bactéries : la plante amène du saccharose via le phloème qui s'enrichit en ammoniaque provenant des bactéries. Mais cette interaction ne se fait quand cas de besoin de la plante, si expérimentalement on enrichit un sol par de l'apport d'engrais , on constate que les plantes diminuent le production de lectine et donc diminuent leur chimiotactisme positif.

 

 

  1. La symbiose avec formation de nodules chez les plantes non légumineuses.

 

 

Frankia fait partie des actinomycètes , ainsi nommé pour leur faculté a produire des filament. Elles sont symbiontes de nombreux arbres .

Elle forme des actinorhizes , cet à dire des racines modifié fixatrices d'azotes. Ce qui permet à ces arbres de se développer sur des milieux pauvre en azote comme les berges et les dunes.

La formation d'un nodule est très proche de celle décrite pour les légumineuses , l'affection s'effectue par l'extrémité d'un poil absorbant.

Il y a alors incurvation du poil et formation d'un hyphe infectieux qui se propage alors vers le cortex .La formation du nodule commence alors. Dans les cellules du cortex il va y avoir formation de nodule qui vont être le siège de la fixation de l'azote.

Il existe peu d'information sur cette symbiose car il est plus difficile d'expérimenter sur des arbres que sur des phabacés. De plus il est également difficile de cultivé Frankia.

 

On sait par contre qu'il existe une hémoprotéine permettant de diminuer la concentration de dioxygène dans la plante.

 

  1. la symbiose sans formation de nodules

 

Les chinois ont remarqué depuis longtemps que lors de la culture du riz , la présence de certaines fougère aquatique entrainerait un meilleur rendement.

Ces résultats proviennent de la présence de cyanobactéries qui à la différence de rhyzobia et frankia vivent en association symbiotique avec des plantes primitives. Les briophytes , les ptéridophytes, les gymnospermes et les sicadés .

Ainsi le genre Anabaena vie en symbiose avec une Azola (fougère) . Cette dernière possède des replis foliaire dans lequel sont concentré les bactéries. Près de 50% de l'ammonium produit par les bactéries se retrouve dans le milieu extérieur , il sera alors utilisé par Azola mais également par le riz.

 

 

  1. La fixation rhizosphérique

 

C'est un cas très particulier, mais dans des régions tropicales on a découvert des bactéries se développent très rapidement aux niveau des racines des poacés. Il y a formation d'un manchon gélatineux où se fixe activement l'azote, ce type d'association fait intervenir des bactéries du type azotobacter

 

 

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