le génie-génétique

Le Génie-Génétique

 

 

Introduction

 

Le génie-génétique est l’ensemble des techniques de biologie moléculaire permettant de manipuler et modifier l’ADN.

Les techniques de bases sont :

  • L’isolement d’acides nucléiques

  • La migration par électrophorèse

  • La digestion enzymatique

  • Le Southern blot

  • Le marquage moléculaire

  • Le séquençage

  • La PCR

Les techniques spécifiques sont :

  • Les techniques de clonages moléculaires

  • Les techniques de mutagénèse

  • Les techniques de transgénèse

 

  1. Le clonage moléculaire

 

Le clonage moléculaire est l’ensemble des techniques permettant d’isoler un gène et de l’insérer dans un vecteur pour l’amplifier. Le produit d’un clonage moléculaire est une Banque Génomique. On appelle alors, Banque, le produit d’un clonage d’ADN de grande taille, et mini-banque, le produit d’un clonage d’ADN de petite taille.

 

Méthode :

On part de l’ADN à cloner auquel on fait subir une digestion enzymatique avec un enzyme de restriction. Après digestion, on obtient donc des fragments d’ADN. Ensuite, on fait subir une digestion enzymatique à un vecteur avec le même enzyme de restriction que l’ADN.

 

Rappel : Il existe deux types d’enzymes de restriction :

  • Ceux à coupure franche

  • Ceux à extrémités cohésives

 

Ensuite, pour éviter la reformation du vecteur, on lui fait subir une déphosphorylation :

Avant déphosphorylation Après déphosphorylation

OH 3’ 5’ P OH 3’ 5’ OH

P 5’ 3’ OH OH 5’ 3’ OH

 

Enfin, on fait fusionner les vecteurs et des fragments d’ADN Grâce à une ligase, on obtient de l’ADN recombinant.

Il va de soit que l’on obtient des ADN recombinants différents à cause des fragments qui ne sont pas les mêmes. On injecte ensuite nos vecteurs dans des bactéries ; C’est l’étape de la transformation. On peut ensuite passer au criblage de la banque de clones.

NB : Dans la bactérie, un plasmide se divise plus vite que le chromosome bactérien lui-même.

 

  1. Le criblage de clones

 

On commence par une titration du produit de clonage, c'est-à-dire qu’on le dilue à différentes concentrations pour pouvoir ensuite établir quelle concentration est optimale pour cribler les clones. 1 2 3 4 5

 

Produit de clonage 1/10 1/50 1/100 1/500 1/1000

Chaque tube contient environ 200µL de solution diluée avec du milieu de culture pur.

On les étale ensuite sur des gels, dans des boites de pétri et on observe le développement des colonies quelques jours après :

  • Les tubes 1, 2 et 3, présentent des colonies trop fusionnées et inutilisables pour le criblage.

  • Le tube 4 présente un nombre de colonies correct et suffisamment espacées.

  • Le tube 5 présente un nombre de colonies insuffisant pour faire le criblage.

On utilise donc la dilution 1/500 pour ensemencer des boites de Pétri.

 

Méthode du criblage  :

On prend l’une des boites de Pétri qui contient des colonies de bactéries transformées avec de l’ADN recombinant. On pose, au contact des colonies, une membrane de nylon ou de cellulose sur laquelle vont s’accrocher quelques bactéries de chaque colonie.

Ensuite, on lyse la paroi des bactéries de la membrane en ajoutant du SDS et de la soude.

Puis, avec des sondes radioactives, on hybride l’ADN des bactéries. Ces sondes sont, bien évidemment, conçues pour s’accrocher uniquement sur les plasmides contenant le fragment d’ADN que nous désirons cloner. On met ensuite le tout à incuber, puis on lave la membrane.

Enfin, on la met au contact d’un film photographique qui va nous indiquer, par autoradiographie, quelles colonies ont fixé la sonde, et donc quelles colonies contiennent l’ADN qui nous intéresse.

Par superposition du film photographique obtenu et de la boite de pétri, on peut ainsi savoir précisément quelles colonies prélever pour cloner l’ADN recherché.

On met nos bactéries prélevée en culture sur des boites de pétri, ce qui nous permet de cloner notre vecteur.

 

NB : Les bactéries utilisées le plus souvent pour ce genre de manipulation sont les Escherichia coli.

 

  1. Vecteurs de clonage

 

Les vecteurs de clonage sont des outils fondamentaux pour le clonage moléculaire car ils sont l’élément d’ADN permettant l’introduction et l’amplification d’un fragment d’ADN connu ou non, dans une cellule procaryote ou eucaryote.

Il existe plusieurs types de vecteurs qui diffèrent de par leur nature, leur origine et leur constitution.

Le choix du vecteur se fera en fonction de la nature et du but de l’étude, mais aussi en fonction de l’hôte dans lequel on désire l’introduire.

Les vecteurs peuvent avoir différentes utilisation :

  • Le clonage et l’amplification d’un fragment d’ADN

  • L’étude des mécanismes de l’expression d’une séquence d’ADN

  • L’introduction de gènes dans des cellules procaryotes, c’est la transformation

  • L’introduction de gènes dans des cellules eucaryotes, c’est la transfection

  • L’introduction de gènes dans un organisme, c’est la transgénèse (OGM)

  • La production d’ARN, ou transcription in vitro

  • La production de protéine à partir de leurs gènes

Les propriétés des vecteurs sont :

  • Ils se répliquent de manière autonome et indépendante du génome de la cellule hôte (surtout les plasmides)

  • Ils ont une petite taille (plus le vecteurs est petit, plus la taille de l’ADN inséré peut être grande) ce qui leur permet une certaine rapidité de réplication et une plus grande facilité de manipulation et de modification

  • Ils permettent la sélection des cellules l’ayant incorporé. Par exemple, si on cherche à injecter des vecteurs contenant un gène de résistance à un antibiotique à des bactéries, et qu’on les traite ensuite avec cet antibiotique. Toutes les bactéries qui n’ont pas intégré le plasmide seront tuées.

  • Ils ne provoquent pas d’interférence avec le bon fonctionnement de la cellule hôte (si ce n’était pas le cas, elles l’expulseraient)

  • Ils sont stables dans la cellule hôte, c'est-à-dire qu’ils ne sont pas modifiés par la cellule

  • Au niveau du site de clonage, ils présentent un grand nombre de sites uniques de digestion, ce qui permet de les utiliser avec de nombreux enzymes de digestion différents sans perturber leur bon fonctionnement

  • Il est facile de les produire en grande quantité puis de las stocker sous forme pure, c'est-à-dire, sans qu’ils n’aient incorporé de fragment d’ADN.

 

Il existe différents types de vecteurs. Dans cette partie nous ne traiterons que les plasmides. Nous verrons les autres plus tard.

 

Les plasmides sont des fragments d’ADN circulaires, extra-chromosomiques, d’origine bactérienne qui ont été modifiés pour que l’on puisse les utiliser. Chez les procaryotes, on note la présence d’un grand nombre de copies de ces plasmides, plusieurs centaines. Sa taille est de 2 à 5 Kb et on peut lui insérer un fragment de 8 à 9 Kb maximum. On peut même aller jusqu’à 10 ou 12 Kb, mais c’est assez rare.

Pour isoler les plasmides d’une bactérie, on peut :

  • Ajouter du chlorure de césium dans le tube qui contient les bactéries clonées. Puis, effectuer une ultra-centrifugation du tube. On obtient alors un surnageant qui ne contient que les plasmides. Mais cette technique est trop compliquée, et donc, peu utilisée.

  • Ajouter un peu de SDS et de soude dans le tube qui contient les bactéries clonées. Cela permet de faire des trous dans leur membrane, assez grands pour laisser sortir les plasmides, mais trop petit pour laisser sortir le chromosome bactérien. On ajoute ensuite une mini-prep de phénol-chloroforme, ce qui nous permet de récupérer les plasmides surnageant en 30 minutes.

  • Utiliser une mini-prep kits sur colonne à la place du phénol-chloroforme, mais les plasmides récupérés sont moins purs et cette méthode est plus difficile.

  • Utiliser une midi ou maxi-prep, mais cela prend plus de temps.

Il existe différentes générations de plasmides :

  • Les plasmides de première génération ne sont pas modifiés.

  • Les plasmides de deuxième génération sont réunis sous le nom de pBR « numéro ». Ils ont subi certaines modifications mais ne sont pas souvent utilisés.

  • Les plasmides de troisième génération sont plus souvent utilisés.

  • Les plasmides spéciaux de dernière génération sont faits sur mesure pour des cas spécifiques

 

Nous parlerons, maintenant, des plasmides de troisième génération.

Les plasmides de troisième génération peuvent être des pSP, des pGEM, ou des bluescript. Ils sont utilisés la plupart du temps pour des clonages simples ou moyennement simples.

Ils possèdent :

  • Une origine F1 : Elle permet la transmission du plasmide d’une bactérie F+ à une bactérie F-. Mais cette origine n’est pas entière car on veut que le plasmide soit transmissible mais pas qu’il soit incorporable au chromosome de la bactérie.

  • Un site de clonage polylinker : Cela permet la digestion du plasmide par de très nombreux enzymes de restriction, mais toujours au même endroit et à seulement quelques bases de différence.

  • Un système d’opéron lactose : Il est coupé par le polylinker. L’opéron lactose permet la synthèse de βgal, donc, si on ajoute du Xgal (solution incolore), la βgal va séparer le gal et le X, ce qui donnera une coloration bleu. Donc, si le fragment d’ADN n’a pas été inséré dans le plasmide, l’opéron lactose est entier et le traitement au Xgal donnera une teinte bleue aux bactéries. Mais, si le fragment d’ADN a bien été inséré dans le plasmide, alors l’opéron lactose est coupé, βgal ne sera pas synthétisé, et la bactérie restera incolore au contact du Xgal.

  • 2 promoteurs : Ils sont placés de chaque coté du polylinker et permettent de faire des transcriptions in vitro du gène inséré dans le plasmide. Les deux promoteurs travaillent dans des sens opposés. Cette propriété peut être utilisée dans trois buts particuliers :

    • La production de ribosondes, pour l’hybridation in situ avec des sondes à ARN

    • L’expression des gènes

    • La production de protéines, comme l’insuline par exemple

Nous développerons maintenant, la partie sur la production de ribosondes.

 

Transcrit par l’ARN polymérase T7

5’ 3’

3’ 5’

Promoteur T7 Promoteur SP6

5’ 3’

3’ 5’

Transcrit par l’ARN polymérase SP6

 

L’ADN sens est représenté en vert et l’ADN anti-sens est représenté en rouge

L’ARN sens est représenté en orange et l’ARN anti-sens est représenté en bleu

Donc, si on met, dans un tube à essai contenant le plasmide, de l’ARN polymérase T7, on obtiendra de l’ARN anti-sens qui sera complémentaire de l’ADN sens. Et, si on met de l’ARN polymérase SP6, on obtiendra de l’ARN sens qui sera complémentaire de l’ADN anti-sens.

Donc, si on veut hybrider le gène sens, on utilise de l’ARN anti-sens comme sonde et l’ARN sens comme contrôle négatif.

 

Nous passons, maintenant, au développement de la partie concernant les plasmides de dernière génération, dont nous avons brièvement parlé dans l’inventaire des différents types de plasmides.

Ce sont des plasmides dans lesquels on a introduit des fonctions spécifiques pour des cas très spéciaux. Il en existe donc différents types, en voici quelques uns :

  • Le système TA cloning qui permet le clonage direct de produits PCR. En effet, les produit PCR possèdent une queue A à la fin de chaque fragment. Nous verrons ce système plus en détail ultérieurement.

  • Le système Gataway qui permet le sous clonage à partir d’un autre vecteur, sans digestion, ni ligation. C’est un système de recombinaison de phage λ. De manière simplifiée, c’est un crossing-over :

 

 

  • Les plasmides permettant des criblages fonctionnels

  • Les plasmides permettant des évènements de splicing

  • Les plasmides permettant l’étude d’interaction protéine-protéine

 

Nous parlerons maintenant du fonctionnement des plasmides permettant des évènements de splicing. Ce système ne peut se faire que chez les eucaryotes car on insert, dans le vecteur, un système d’introns et d’exons. Entre nos deux promoteurs, on insert deux exons dont on connait précisément la taille, entre lesquels se trouvent le site de clonage.

Pour finir, on effectue une PCR sur les fragments obtenus, puis on fait migrer les produits de PCR sur des gels par électrophorèse. Si on obtient des fragments plus gros, on sait qu’il y avait un exon dans le fragment d’ADN inséré dans le plasmide.

 

  1. Banques de clonage

 

L’édification d’une banque de clonage est basée sur le clonage d’ADN génomique procaryote ou eucaryote. Ce sont des collections de clones inconnus (anonymes).

Il existe deux types de banques différentes suivant le type de digestion que l’on a utilisé pour la mettre en place :

  • Digestion totale : L’ADN est réduit au maximum car tous les sites de restriction sont coupés

  • Digestion partielle : on obtient des fragments d’ADN plus gros car tous les sites de restriction ne sont pas coupés

La taille maximum d’un insert dans un plasmide est de 104 bases et le génome humain en compte 3.109. Il faut donc 300000 clones pour couvrir la totalité du génome de l’Homme. Mais on n’est jamais sûr d’avoir tous les fragments en ne clonant qu’une fois le génome. C’est pourquoi, on répète ce travail 3 ou 4 fois, ce qui aboutit à un total de plus d’1000000 de clones pour une couverture totale. Or, pour qu’une banque soit jugée terminée, il faut multiplier le nombre de couvertures par 3 ou 4, encore une fois. On obtiendrait donc une banque de 3 à 4000000 de clones.

Il est évident que c’est un travail trop laborieux pour être effectué ainsi. C’est pourquoi, on a inventé des vecteurs capables de contenir de plus grands inserts que les plasmides. Nous les verrons dans les prochaines parties.

Les utilisations qui peuvent être faites d’une banque génomique sont multiples. En voici quelques unes :

  • Construction de cartes physiques : Ce sont des cartes de restriction du génome entier, elles diffèrent des cartes génétiques avec recombinaison car, bien que l’ordre des gènes soit évidemment le même, les distances entre ceux-ci sont différentes et sont beaucoup plus précises dans le cas des cartes physiques.

  • Séquençage du génome : Il est impossible de séquencer un chromosome entier, c’est pourquoi les banques sont une bonne alternative. A condition, bien entendu, que l’on puisse remettre les fragments séquencés dans l’ordre grâce à une carte physique.

  • Isolement des clones génomiques d’un gène donné afin d’étudier l’expression de ce gène, par exemple.

  • Séquence génomique d’un gène donné.

  • Isolement de séquence potentielle de régulation : qui ne sont pas transcrite et ne sont donc pas présentes dans les banques d’ADNc.

  • Isolement de séquences non transcrites comme les introns, ou les séquences régulatrices.

La méthode pour construire une banque génomique est exactement la même que pour effectuer un clonage moléculaire. A une exception près tout de même, on s’arrête après la transformation des bactéries et ne passe pas au criblage des clones.

 

NB : Une banque d’ADNc est une banque de clone d’ARN. Elle ne contient donc que les exons, dépourvus de leurs introns et de leurs séquences régulatrices. Nous verrons ce types de banque plus en détail dans la suite du cours.

 

  1. Clonage fonctionnel

 

Le principe du clonage fonctionnel est d’utiliser les fonctions d’un organisme particulier pour effectuer l’injection du vecteur dans la cellule cible.

Dans cette partie, nous travaillerons sur le vecteur phagique.

Un phage ou bactériophage est un virus spécialisé pour un certain type de bactéries.

On utilise donc trois fonctions du phage :

  • Sa capacité à injecter de l’ADN étranger dans les bactéries

  • Sa prolifération cellulaire et la lyse de la bactérie infectée

  • Le fait qu’il infecte les autres bactéries alentours

La taille du vecteur phagique, c'est-à-dire l’ADN du phage modifié est de 2 à 5 Kb (même taille qu’un plasmide) et la taille maximale d’un fragment cloné est de 10 à 40 Kb, soit 3  à 4 fois la taille d’un insert de plasmide.

Le système d’injection du phage est donc très pratique, mais la difficulté de manipulation de ce matériel est très importante. C’est pourquoi, cela prend beaucoup de temps de faire des banques avec des vecteurs phagiques.

 

  1. Préparation et utilisation des phages

 

Pour commencer on met des bactéries en culture dans un milieu adapté, de manière à créer un milieu favorable à la culture des phages. Le nombre de bactérie va alors croitre de manière exponentielle jusqu’à un plateau. Lorsque la densité optique du milieu atteint une valeur

λ = 600, c’est que la concentration de bactéries dans le milieu est d’environ 4.108 bactéries/mL.

 

 

 

On ajoute ensuite les phages à une concentration d’environ 107phages/mL, puis on laisse le tout à 37° pendant 5 minutes de manière à ce que les bactéries absorbent les phages.

La culture se fait pendant la journée car elle doit être suivie de très près. Elle se déroule en trois phases majeures :

  • Première phase : La densité optique continue d’augmenter car c’est la prolifération bactérienne qui prédomine

  • Deuxième phase : Elle commence environ 4 ou 5h après l’ajout des phages en fonction de la concentration. La densité optique diminue car la lyse bactérienne commence

  • Troisième phase : Elle commence environ 6 ou 8h après l’ajout des phages. La culture est presque transparente, donc la lyse est presque totale. On arrête la culture en la mettant au réfrigérateur.

On extrait ensuite l’ADN phagique pour le préparer. Le protocole de préparation est similaire à celui des plasmides. On utilise une mini, midi ou maxi-prep en fonction du volume que l’on a à traiter.

A ce moment, l’ADN phagique est près au clonage, il est équivalent à un plasmide vide.

 

  1. Clonage des phages

 

les phages les plus couramment utilisés sont les phages λ. Il fonctionne selon deux phases :

  • La phase lytique : c’est la phase destructrice de la bactérie

  • La phase lysogène : c’est une phase de repos dans la bactérie. Mais s’il y a une quelconque perturbation du phage, il passe immédiatement en phase lytique.

 

Le problème de l’ADN phagique est qu’il n’est pas circulaire. Mais il possède ce que l’on appelle des extrémités « cos » qui reconnaissent certaines protéines de la capsule du phage qui vont nous être utiles.

Nous commençons par éliminer les parties du génome phagique qui ne nous sont pas utiles comme la partie centrale et certains gènes comme, par exemple, les gènes de la phase lysogène. Cela permet de réduire la taille du vecteur et donc d’augmenter la taille de l’ADN à insérer. (cf schéma poly p7)

Pour la suite de la manipulation, on utilise les propriétés des extrémités cos du génome phagique.

 

 

Méthode :

On accole les ADN phagiques par leurs extrémités cos grâce à une ligase. Cette ligation nous permet d’obtenir un concatémère. Puis on effectue une digestion de ce concatémère grâce à une enzyme de restriction à extrémités cohésives. La partie centrale est éliminée de cette manière. On sépare ensuite les fragments. Pour cela on peut utiliser différentes méthodes qui sont citées sur le schéma. Pour finir, on récupère les bras ligaturés, qui possèdent, maintenant, des extrémitées cohésives capables de se lier à d’autres fragments d’ADN.

Parallèlement, on effectue une digestion de l’ADN génomique à cloner avec le même enzyme de restriction que celui utilisé pour l’ADN phagique. Cependant, on le fait travailler dans des conditions qui ne sont pas optimales, de manière à n’obtenir qu’une digestion partielle. On obtient ainsi des fragments de l’ordre de 8 à 22 Kb.

On lie ensuite l’ADN phagique et l’ADN génomique au moyen d’une ligase. De cette manière, on a de l’ADN recombinant.

L’étape suivante est l’encapsidation. On ajoute des protéines de la tête qui permettent la formation de la capside et la liaison des extrémités cos aux protéines prévues à cet effet.

Puis on ajoute des protéines de la queue. Et on obtient notre vecteur final, des phages recombinants qui contiennent de l’ADN recombinant.

Avec cette technique, le rendement de recombinaison est presque de 100%.

 

  1. Obtention de la banque génomique

 

La séparation des clones se fait sous forme de plages de lyse. C’est l’équivalent des colonies bactériennes mais en inversé.

 

 

 

 

Il est nécessaire de calculer la concentration de phages obtenus. Pour cela on utilise une méthode expérimentale et donc approximative ; la Titration.

La concentration e phage est égale au nombre de plage de lyse en pfu (unité de formation des plages de lyse) par millilitre. Cela nous donne une indication du nombre de plage de lyse par boite.

On effectue des dilutions des phages recombinés avec du milieu de culture pur.

Par exemple :

  • Tube 1 : 10-2

  • Tube 2 : 5.10-3

  • Tube 3 : 10-3

  • Tube 4 : 5.10-4

  • Tube 5 : 10-4.

Chaque tube contient environ 200µL de solution. On ajoute ensuite 1µL de bactéries par tube, pour que l’ADN recombinant soit absorbé. Puis, on étale le contenu de chaque tube sur une boite de pétri remplie de bactéries. On recouvre ensuite le tout avec une couche d’agar mou de manière à ce que les bactéries et les phages ne bougent pas trop.

Enfin, on met les boites de pétri en culture surveillée à 37° durant 5 à 6h.

 

 

 

 

 

 

  1. Autres vecteurs

 

 

  1. Le YAC : Yeast Artificial Chromosome

 

Nous avons exploré précédemment, les limites du clonage grâce au plasmide et celles du clonage grâce aux phages. Devant ces constatations, les scientifiques ont essayé de trouver un nouveau vecteur de clonage. C’est la naissance du YAC, vers la fin des années 80.

La recombinaison de l’ADN grâce au YAC, comme son nom l’indique, se fait par le biais de levure. Les levures possèdent 16 chromosomes de tailles différentes variant de 250 Kb à 2 Mb (alors qu’un chromosome humain fait en moyenne 50 Mb).

 

  • Structure d’un YAC

 

 Le YAC est composé de différents éléments :

  • TEL : 2 séquences télomériques

  • CEN : 1 séquence centromérique

  • ARS (Autonomous Replicating Sequence): Une séquence d’origine de réplication

  • URA3 : Un gène pour sélectionner les levures avec un YAC. Celle qui ne l’on pas incorporé vont mal pousser.

  • SUP4 : un gène de sélection des levures avec un YAC recombinant qui fonctionne sur le même principe que l’opéron lactose dans le plasmide. Il est impliqué dans le métabolisme des bases azotées. Si la colonie devient rouge, c’est qu’il y a eu un insert au milieu du gène. En revanche, si la colonie reste blanche, c’est que le gène est resté entier et que l’insertion n’a pas été effectuée avec succès.

  • Plasmide pBR : Présence d’une origine de réplication et d’un gène de résistance à un antibiotique ce qui permet également une sélection des levures ayant incorporé le YAC ou non.

  • BamH1 : Il y a deux sites de digestion de l’enzyme de restriction BamH1, ce qui permet de linéariser le YAC pour qu’il ait la forme d’un chromosome.

  • EcoRI : il y a un site de digestion de l’enzyme de restriction EcoRI qui aboutit à des extrémités cohésives. Ceci permet d’insérer l’ADN à cloner.

Il existe différents types de YAC avec des propriétés différentes, mais ils doivent tous être reconnus et se comporter comme des vrais chromosomes pour pouvoir être acceptés dans la levure.

 

  • Clonage (préparation) d’un YAC recombinant

 

Le YAC vide et circulaire se situe dans une bactérie, comme un plasmide. La préparation de son ADN se fait de la même manière que celle d’un plasmide.

Pour commencer, on ajoute l’enzyme de restriction BamHI qui va linéariser le YAC et ainsi libérer ses extrémités télomériques. Comme pour le plasmide, on déphosphoryle ses extrémités pour éviter qu’il se referme.

On fait ensuite subir une digestion partielle avec l’enzyme EcoRI à l’ADN génomique à cloner. Puis, on purifie les tailles des fragments obtenus en les faisant migrer sur un gel d’électrophorèse à champs pulsé (nous expliquerons cette technique ultérieurement).

Ensuite, on digère totalement le YAC avec l’enzyme de restriction EcoRI.

Et enfin, on effectue une ligation entre les YAC et l’ADN génomique à l’aide d’une ligase.

 

NB : A la place de EcoRI, on peut également utiliser des enzymes de restrictions qui coupent les ilôts CPG (c'est-à-dire les zones très riches en bases CG) et pourront ainsi fournir des gros fragments d’ADN en travaillant dans des conditions optimales.

 

  • Transformation des levures

 

Grâce à un traitement enzymatique, on détruit totalement la paroi de chitine des levures et on perméabilise leur membrane. On ajoute les YAC recombinés, puis o

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